干货丨干细胞疗法治疗糖尿病：进展与挑战
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潜心研究
我们将走的更远
一个世纪以前，1型糖尿病意味着死刑。现在，它只是日常病。著名国际期刊《Cell Stem Cell》刊登了一篇综述，这篇综述阐述了干细胞治疗糖尿病的关键技术和核心问题。文章从如何生成功能完整的胰岛，胰岛细胞移植中存在的免疫问题，再到干细胞微囊化的未来方向与策略。是一篇值得学习的好文章。
干细胞与糖尿病
近一个世纪以来，重组胰岛素合成和给药方式的进步从根本上降低了糖尿病相关疾病的发病率和死亡率。尽管如此，全世界仍有4亿的病人因糖尿病并发症而遭受着致命的影响，如糖尿病肾病、眼病和神经系统疾病。严格的饮食控制，可以减缓或预防I、II型糖尿病并发症的发展。遗憾的是，这种严格的饮食控制也会引起低脂血症，因而措施的实施也受病人状况的限制。通过实体胰腺器官移植或胰岛移植的方法来替代β细胞，都可以达到不使用胰岛素而使病情获得良好控制的目的。由于胰岛组织的来源有限，因此，用干细胞生产出充足的分泌胰岛素的细胞资源，将可以满足β细胞替换、达到胰岛素非依赖的广泛需求。
干细胞技术的发展，组织工程的进步再加上生物材料的发展，使得其离临床转化越来越近，成为最有潜力的糖尿病替代治疗策略。然而，干细胞治疗糖尿病关键技术和核心问题仍有待深入研究和克服。
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如何生成功能完整的胰岛
近十余年，用人源干细胞生产功能性β细胞取得了显著的进展。基本策略是重演了胚胎时期多能干细胞分化的主要路径：形成明确的内胚层，然后胰腺内胚层，再到内分泌前体细胞（祖细胞）并最终形成胰岛细胞。最近的研究重点在生产对葡萄糖刺激产生响应并分泌胰岛素的单个细胞上。几个研究室的精力集中在生产功能完整的β细胞和胰岛细胞，并且很快可以作为胰岛素分泌细胞的资源来替代人的胰岛。
图-1 胰腺由外分泌和内分泌区域组成。后者由称为朗格汉斯岛(Inset)的小球样微型器官组成。每个胰岛都含有分泌胰岛素的β细胞，以及其他分泌激素的内分泌细胞(α、δ、epsilon和PP细胞)。所谓的“中心”细胞是β细胞的一个亚群，它协调胰岛细胞在葡萄糖刺激后协同释放胰岛素。内分泌细胞不是孤立存在的，而是存在于各种细胞组成的小生境中：包括基质细胞、神经细胞、内皮细胞和血管周细胞。
尽管从人源胚胎干细胞制备胰岛素分泌细胞取得了明显的进展，但完美地复制内源β胰岛细胞所有特点并实现其所有功能的细胞形成过程仍然有待阐明。考虑到机体内的β胰岛细胞不是独立存在的，而是处于错综复杂的3D胰腺环境中，因此制备“完整”的胰岛细胞应当有助于胰腺功能重建。事实上，β细胞功能的维持高度依赖于胰岛复杂的细胞结构，而分离态的胰岛细胞与完整结构中的胰岛细胞的行为不同。比如，由于基础胰岛素分泌量和葡萄糖刺激下最大胰岛素分泌量下降，分离态的β细胞跟完整结构状态中的细胞相比，其葡萄糖刺激下的胰岛素分泌功能低下。加之其它机制，像细胞-细胞信号交流的协调、细胞间隙连接蛋白Connexin-36等均在维持胰岛素水平波动中与β细胞联结和胰岛同步过程发挥重要作用。
考虑生产最理想效果的治疗糖尿病治的人胚胎干细胞，所以制备细胞时必须考虑如何重建胰岛细胞与细胞的接触和胰岛与微环境交流的结构。
β细胞另外一个主导性功能是与胰岛小生境中其它细胞的信息交流，包括多种非内分泌型细胞，如内皮细胞、周细胞、神经细胞和间充质细胞。特别是，胰腺中胰岛的血管高度发达，可能每一个β细胞都与内皮细胞产生一个或多个接触，并在接触处形成特殊的超微结构。在胰腺发育过程中，内皮细胞最初被内分泌细胞分泌的VEGF-A招募到迅速生长的胰岛。然后是内皮细胞合成和分泌胰岛膜基质，并作为β细胞生长、存活和功能的关键调节因子。Otonkoski团队研究表明，人胰岛中围绕内皮细胞和β细胞出现二个基膜。鉴于在自然环境中β细胞与支持细胞之间的特殊关系，在体外重塑内源性β细胞小生境中某些元素可能促进hESC衍生β细胞的存活和功能。
胰岛血管小生境不仅包括内皮细胞，还包括壁细胞，称为周细胞。周细胞包裹在内皮细胞管周围，以提供结构支持和产生成熟功能的血管并调节内皮细胞的增殖、存活和功能。周细胞在正常胰岛功能中的作用还不完全清楚，而遗传敲除研究则表明，成年鼠胰岛中周细胞的缺失会导致胰岛素表达和葡萄糖清除的障碍。
鉴于胰岛细胞结构对内分泌功能的重要性，可以设计培养系统来再现发育过程中胰岛复杂三维结构的诸要素。各种方法被用于体外产生工程胰岛，或所谓的‘假胰岛’。多项研究报告表明，无论是在体外还是在体内，移植了假胰岛的再聚体之后，功能都得到了改善。也有证据表明，与仅由β细胞组成的假胰岛相比，β细胞与内皮祖细胞重新聚集在一起后，GSIS（葡萄糖刺激的胰岛素分泌）得到了改善。
图-2 用人多能干细胞(hPSCs)生产β样细胞涉及到促进多能干细胞通过一系列中间祖细胞的阶段。在完成定向分化后，可以被解离β样细胞簇并重新聚集成确定大小和组成的胰岛样细胞团。与其他类型内分泌细胞(它们本身可能来自hPSCs)的再聚集可能改善葡萄糖自我平衡功能，可能是通过某些hPSC衍生的β细胞向中心细胞的分化。最后，内分泌细胞可以随小生境细胞一起重新聚集，更紧密地再现对β细胞功能至关重要的局部微环境的相互作用。
总之，确定最适合人体胰岛功能的细胞组成和结构布局，仍需要做更多的工作。可能的挑战包括确定如何获得所需的人胰岛小生境中的种子细胞，特别是考虑到某些细胞类型缺乏真正具体的标记，而且来源有限。一种选择是从hESCs或诱导多能干细胞(iPSCs)中产生这些细胞。另一个挑战是，目前创建人工胰岛的技术依赖于内分泌细胞和非内分泌细胞之间的自组织特性。也许有一天，胰岛组织的3D打印或许成为可能，从而能够完成所希望的结构。
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胰岛细胞治疗中存在的免疫问题
最近使用β细胞替代治疗T1D的成功，再加上hESC-或iPSC衍生β细胞的生产，为有效治疗该疾病提供了路线图。然而，免疫系统问题仍然是广泛采用细胞替代疗法治疗T1D和部分T2D患者的主要障碍。目前的免疫抑制剂是有效的，但需要终生治疗，而且在许多情况下会产生副作用和毒性，因此多数采用这种治疗策略时仍限于非常严重的病例。
1）首先是同种免疫排斥的问题。
在T1D患者中，移植的异基因β细胞面临同种免疫介导的排斥反应，如果不被抑制，可以在几天内清除移植的细胞。T细胞是同种免疫的主要因素，其激活是由于T细胞受体(TCR)识别主要组织相容性复合物(MHCs)结合的抗原肽所致。MHC蛋白的高度多态性(在人类中称为人类白细胞抗原HLAs)是异基因免疫攻击的主要靶点，次要组织相容性抗原，如女性受体中出现的男性抗原或线粒体抗原，尽管速度较慢，也能引起排斥反应。
虽然免疫抑制保护移植物免受排斥，但广泛的免疫抑制损害了患者的免疫系统，使他们容易受到感染和恶性肿瘤的侵袭。一种理想的策略是训练免疫系统接受移植的细胞，避免慢性全身免疫抑制。许多临床前动物模型已经实现了对移植组织的免疫耐受，目前，正在为人类开发潜在的耐受性疗法。
在过去的20年中，人们一直在共同努力研究诱导移植耐受性的策略，其中策略之一就是：构建供者-受体造血嵌合体。供体免疫细胞的存在，将培养受体免疫细胞接受供体来源的细胞作为自身细胞，从而防止移植排斥。这种方法的一个挑战是混合嵌合状态的不稳定性，导致宿主或供体免疫系统失衡而被一方主导并接管。当供体细胞占优势时，移植物抗宿主病的风险就很高；当受体细胞占上风时，对供体的耐受性往往会丧失。另一种策略是：用过继细胞疗法促进Tregs功能。过继性Treg治疗的一个挑战是，大量的可对供体反应的效应T细胞可以压倒Treg介导的抑制。用Tregs控制排斥反应，需要减少受体体内针对供体产生反应的T细胞。不断有新的临床前结果表明，Treg细胞治疗可以稳定造血嵌合体，因此，这两种疗法有可能协同作用，以实现更可靠和持久的耐受性。
2）其次是自身免疫的问题。
在T1D患者中，胰岛自身抗原特异性T细胞也可以攻击和破坏移植的β细胞，从而促使移植的β细胞被排斥。控制T1D患者自身免疫复发而排斥移植β细胞的策略，可以采取在研究控制T1D患者自身免疫中使用的措施。
已经做了广泛的研究工作使得T1D患者恢复自我免疫耐受。有趣的是，许多通常用来预防移植排斥的免疫抑制药物并不能有效地诱导糖尿病的缓解。然而，大多数常用于预防同种免疫介导的移植排斥的免疫抑制药物，都可导致短期糖尿病缓解，但没有长期疗效。在免疫抑制的胰腺和肾移植受者中，传统药物用于抑制自身免疫反应，也观察到攻击胰岛细胞的自身免疫复发。T细胞和B细胞靶向治疗，如抗CD3，Abatacept (类似于上述的CTLA-4Ig分子)和抗CD-20，可使一些新的T1D患者的β细胞功能暂时停止下降。抗胸腺细胞球蛋白是一种在器官移植中常用于诱导T细胞衰竭的药物，在高剂量时不能防止β细胞丢失，低剂量与G-CSF联合使用时具有短期效益。相反，另一种T细胞靶向剂LFA-3Ig(Alefacept)能稳定新发疾病患者的β细胞质量。抗CD3、Abatacept和alefacept的共同之处在于，它们对效应T细胞具有相对的选择性，同时保留甚至增强Tregs。因此，它们的治疗效果可能是由于能够在阻止效应T细胞的同时促进Treg的功能。这些在控制胰岛自身免疫攻击效果的提示，为设计更有效的联合疗法，以诱导长期耐受性提供了指导。
表-1 用于同种免疫和自体免疫反应的免疫调节药物。
除了上述广泛的免疫调节策略外，也有研究持续努力地发展胰岛抗原特异性治疗方法。临床前的数据表明，用胰岛主要抗原制备的肽疫苗或纳米微粒可以靶向于特定的效应细胞来诱导免疫耐受，但这些策略在患者中的有效性仍有待临床试验证明。虽然这些研究中有许多已经在少数病人群体中显示了一些效果，并且有几个项目正在进行新抗原治疗的尝试，但确定精确的抗原、时间和给药方法是至关重要的，以期最大限度和有效地测试疗效。抗原特异性免疫治疗面临的挑战是免疫系统所针对的胰岛抗原的数量；仅解除针对一种或一群胰岛抗原特异性T细胞的杀伤功能不足以改变疾病的进程。此外，在不同的患者、不同的疾病阶段，胰岛抗原的特异性可能是不同的，因此很难知道哪些特异胰岛抗原才是目标。诱导主要抗原特异的免疫调控的方法可能更有效，更容易应用于不同的患者群体。
Treg细胞治疗提供了许多有吸引力的特点，关乎效应T细胞对主要抗原特异性反应的调节。例如，Tregs通过‘关联抑制’和‘传染性耐受’来控制不希望的免疫反应。在关联抑制中，由一个抗原激活的Tregs可以抑制在同一组织微环境中出现的针对其它抗原的反应。在传染性耐受中，Tregs创造了一个耐受性组织微环境，从而使附近其它的激活T细胞采取调节而不是效应命运。这使得Tregs的抑制性能够随着时间的推移而传播，而不仅仅局限于起始细胞的存在。这些特性确保特异性有限的Tregs能够对局部其它免疫细胞进行特异、显著和持久的控制。的确，单次注射胰岛抗原特异性Tregs可诱导自身免疫性非肥胖糖尿病小鼠糖尿病终生的缓解。目前，Treg细胞治疗T1D患者的早期试验正在进行中，显示了这种方法在患者中的可行性和安全性。
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干细胞微囊化的未来方向与策略
干细胞可改善和治疗诸多疾病是不争的事实。本文前面对干细胞来源胰岛细胞的生产和面临的免疫障碍进行了介绍，而实际面临的进展和挑战要更麻烦。比如，临床上，胰岛移植的技术越来越成熟，对移植位置和血供等等的研究使得胰岛移植成为治疗的金标准；患者健康状况也需考虑，以保证临床治疗手段可得到满意的临床疗效。
由于干细胞生产的β细胞越来越接近内源性细胞的特点，使之临床应用越来越靠谱，然而，免疫排斥的困难仍不容小觑。用基因编辑的方法来剔除免疫相关基因来减低免疫排斥或提升免疫耐受，但是，由于细胞复杂、相互关联和制约的关系，容易造成免疫系统失衡，仍需要深入和谨慎的考量和抉择。
采用组织工程的方法把胰岛素分泌细胞包裹到特殊材料的微型胶囊装置里，一方面可以提供胰岛素分泌细胞，另一方面可以限制免疫细胞的攻击。虽然实际操作过程中，也面临了诸多的复杂问题，尤其是技术实现手段的问题，但仍有临床实验产品的推出。因此，前景依然看好。
干细胞微囊化已经进入临床试验阶段。2014年，第一例基于ESC治疗1型糖尿病产品的进入临床试验（NCT02239354），命名为VC‑01（ViaCyt公司），是hESC衍生的胰腺内胚层细胞（称为PEC‑01细胞），是一种皮下注射植入式半渗透释药装置，可以免疫隔离，允许氧气和营养物质通过。这是一项开放性的1/2期临床试验，评估了糖尿病治疗候选药物PEC-Encap 的安全性、耐受性以及疗效。还有另一个临床试验（NCT01652911），这产品不能进行免疫隔离，将其植入皮肤下血管处30天后，随后再植入胰岛细胞。这项为期3年的临床试验在招募了3个患者之后中终止了。
总的来说，相关学科快速的进展，为糖尿病患者治疗提供了新的可期待的治疗途径。尽管这些领域仍有不小的技术障碍，但新的胶囊技术、新的免疫调节方法、干细胞分化方法的改进和基因编辑手段的结合应用，新技术将给T1D和T2D患者带来了革命性的现代细胞治疗方法。
参考资料：
Stem Cell Therapies for Treating Diabetes：Progress and Remaining Challenges
相关科普：
Cell Rep：干细胞治疗1型糖尿病的尝试，这次是组织工程
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